文章导读：

Meloidogyne incognita分布广泛，被认为是世界范围内危害最大的作物寄生虫之一。由于它是一种无杂交物种，寄主范围广（难以采用轮作作为管理措施），并且具有定居的生活方式，繁殖率高，世代时间短的特点，因此极难控制。传统上，在作物生产过程中使用杀线虫剂和土壤熏蒸剂来控制根结线虫的感染。然而，这些药剂通常对人类和非目标土壤生物具有不利的毒性，因此需要其他替代策略。

植物在逆境中并不是单打独斗的，因为它们经常暴露在根系周围土壤中的微生物中。根相关微生物（RAM）似乎与其植物宿主共同进化，并能够通过赋予植物对胁迫的耐受性、增强植物对寄生虫的抗性和促进根系结构来促进植物健康。近年来，新出现的证据表明，当植物受到恶劣环境的挑战时，生物胁迫可以诱导植物重新组装其原生RAM，以最大限度地提高营养和防御能力。值得注意的是，生物胁迫诱导的植物中原生RAM重组并不只存在于抗病土壤中，而可能广泛存在于植物-土壤系统中。然而迄今为止，关于RAM在植物-根结线虫相互作用中所起作用的信息很少。

2024年8月7日，中国农业大学高丽红教授和田永强教授团队在Nature Communications 期刊发表题为“Protective role of native root-associated bacterial consortium against root-knot nematode infection in susceptible plants”的研究论文，研究从根结线虫感染的根中分离的多种本地细菌菌株具有线虫拮抗活性，由6株细菌组成的多个简化合成群落（Symcom）对植物中根结线虫感染有明显的抑制作用。这些抑制作用包括直接抑制感染、分泌抗线虫物质和调节植物防御反应等多种机制。迈维代谢为本研究提供植物广泛靶向®代谢组检测和分析服务。

研究结果

1.在原生微生物群存在的情况下，植物对根结线虫的敏感性较低

首先收集来自中国不同地区的12种不同性质的土壤，并观察到与γ-灭菌条件相比，人工感染根结线虫后，未灭菌条件下植物的虫瘿数明显减少，这表明在天然微生物组存在的情况下，植物对根结线虫的敏感性普遍降低。

为了辨别观察到的RKN抑制是一般性的（归因于全球微生物负荷）还是特异性的（归因于少数功能性微生物群），进行了土壤移植实验，观察到12种土壤中只有一半表现出特异性的RKN抑制。随后，为了进一步测试本地微生物组是否对植物抵抗根结线虫存在有益的影响，使用三种不同地理来源（图1b）的未消毒或γ-消毒的土壤中种植黄瓜植株，并人工感染根结线虫（图1a）。这三种土壤的微生物组成在不同门的相对丰度、α-多样性和β-多样性方面存在显著差异（图1c）。尽管如此，在所有三种土壤中，未灭菌条件下与γ灭菌条件下相比，植物的根瘿症状较弱（虫瘿更小，更少）（图1d），虫瘿和虫卵数量显著减少（图1e）。强调原生微生物群在植物保护中的普遍作用。

为了描述根结线虫诱导的RAMs变异，对根结线虫侵染和未侵染植物的根际（RS）和根内圈（RE）微生物群落进行了详细分析。微生物组组成分析显示，线虫处理（感染与未感染）在所有三种土壤中的RS细菌中以及在三种土壤中的两个的RE细菌中存在显著差异（图1 f）。相比之下，真菌在大多数情况下没有观察到显著差异（除了3-SX位点的RS真菌）。这些结果表明线虫感染改变的是细菌而不是真菌。此外，效应大小（LEfSe）的线性判别分析表明，在线虫感染条件下，在所有三种土壤中，几种细菌类群在RS或RE中一致富集（图1g）。总之，这些结果证实了根结线虫诱导的原生细菌重组，这在土壤中很常见。此外，在未灭菌条件下，根结线虫侵染并未导致土壤性质的显著变化，这表明植物根际分泌物的变化，而不是土壤条件的变化，可能在根结线虫感染后细菌组装过程中起正反馈作用。

图1.原生微生物群降低植物对根结线虫易感性的效率

2.根结线虫感染在时间尺度上改变了根细菌微生物组的组装

为了探索根结线虫感染下细菌RAMs的时间周转模式，对未感染和感染根结线虫植物生命周期中的根细菌微生物组进行研究（图2a, b）。在时间尺度上，RAMs存在时，植物对根结线虫的敏感性较低。尽管在根结线虫根部发育过程中，细菌微生物组对线虫感染表现出复杂和可变的反应（图2c），但其组成通常受到线虫处理（感染与未感染）和采样时间的相互作用的影响（图2d）。

PCoA的第一个轴显示了根结线虫介导的细菌群落组成的时间变化:虽然未感染和被感染的植物遵循相似的轨迹，但一旦根结线虫入侵发生（特别是在3dai的RE），被感染的植物就开始与未感染的植物分化，并在35dai的RS和RE中显示出明显的偏差（图2e）。特别是，在至少一个时间比较中，LEfSe分析表明，在根结线虫感染后，根相关室中富集的细菌类群数量（40）超过了消耗的细菌类群数量（25）（图2f）。为了破译植物根际分泌物在细菌微生物组组装过程中所起的作用，利用代谢组技术表征了根结线虫感染诱导的根际代谢变化（在14 dai），并观察了到独特的代谢模式（线虫感染与未感染;图2g-i）。此外，连锁分析显示，在根结线虫感染后，根际代谢物的变化与细菌OTUs之间存在很强的共现关系（图2j）。综上所述，在根相关区室中，根结线虫感染反应性细菌类群沿着根结线虫的生命周期遵循不同的轨迹。

图2.细菌根相关微生物（RAMs）在时间尺度上的变异

3.原生微生物群的细菌多样性丧失加剧了植物对隐芽孢杆菌的易感性

为了研究RAM在保护植物免受根结线虫侵害方面是否存在功能冗余，采用稀释-0方法在原生微生物组中创建了广泛梯度（图3a）。正如预期的那样，在稀释和重新引入后，RS和RE中都出现了不同的细菌组装过程（图3b）。然而随着稀释水平的增加，RS中观察到细菌α-多样性（观察到的OTUs）急剧下降（图3c），但在RE中没有。此外RS和RE稀释水平之间的细菌微生物组组成差异显著（图3d），稀释水平与RS中细菌β-多样性有很强的相关性（p < 0.001;图3e），但在RE中没有。

其次在根结线虫感染条件下，随着稀释水平的增加，根瘿症状的严重程度呈增加趋势（图3f-h）。值得注意的是，细菌多样性与其预测功能密切相关（用Fric指数表示，p < 0.0001;图3i），表明多样性的丧失意味着细菌群落潜在功能的丧失。RS细菌群落的多样性和功能与植物对根结线虫的易感性呈显著负相关（图3 j）。综上所述，由于原生微生物组的细菌多样性丧失加剧了植物对根结线虫的敏感性，因此根结线虫的抑制主要归因于根际细菌联盟（而不是个体成员），它们采用协同调节（而不是个体效应）策略来保护植物免受根结线虫的侵害。

图3.根相关微生物(RAMs)细菌多样性丧失对植物对根结线虫易感性的影响

4.具有拮抗功能的细菌筛选

为了研究原生根相关细菌对根结线虫的抑制能力，从根结线虫感染的根中建立了一个分类多样化的细菌培养集合（图4a）。去除克隆重复后共获得212株独特的细菌菌株，覆盖32个细菌属，表明分离的菌株具有很高的多样性（图4b）。

接着通过体外实验检测的幼年死亡率筛选能够抑制根结线虫的细菌菌株。最终观察到45种不同的细菌菌株对根结线虫幼虫造成了一定程度的死亡率，占分离到的独特细菌菌株总数的21.2%（图4c）。这些功能菌株被分类为27个细菌属，占本研究细菌属的84.4%（图4d）。值得注意的是，有21种功能菌株强烈抑制了根结线虫的存活（校正后的线虫死亡率> 90%）（图4c）。此外22株功能菌株对植株生长性能无不良影响（接种功能菌株与对照（未接种）植株性能之比> 1.0，则认定为对植株生长无不良影响的特定菌株）。

根据线虫死亡率检测和植物性能评估的结果，进一步选择了14种高性能功能菌株（HFS），这些菌株具有明显的拮抗根结线虫活性，而不抑制植物性能（图4f）。盆栽试验进一步验证了这14种HFSs在黄瓜根中对根结线虫的拮抗作用。与对照组（无细菌菌株）相比，所有14种HFSs都有效地减少了每克根的虫瘿或卵团数量（图4f, g），表明它们能够降低植物对根结线虫的敏感性。总的来说，这些结果强调了不同范围的本地根相关细菌菌株对根结线虫感染具有拮抗活性。

图4.原生细菌菌株抑制根结线虫幼虫的能力

5.多种SynComs具有抑制植物中根结线虫感染的能力

为了评估菌株多样性如何控制根结线虫对根系的感染，沿着菌株数量的梯度从一个池中随机选择菌株，以测试根结线虫感染模式是否沿HFS数量呈现一致的方向趋势（图5a）。随着HFS数量的增加，根结线虫的感染率呈负s型下降趋势（图5a），说明HFS数量相对较少时，可达到最大的加性/协同效应。结果表明，6株HFS的感染率较低，多株HFS的感染率保持相对稳定，说明6株HFS足以构建高度简化的SynCom，能够显著降低根结线虫的感染率。

因此进一步随机组合构建了6种HFS的10种不同组合，结果表明各SynComs均能显著降低根结线虫感染率，其中SynCom C对根结线虫感染的抑制作用最强（p < 0.0001;图5 b）。SynCom C的6个HFSs被分类为5个细菌属，所有这些细菌都在3种不同土壤中一致地观察到。体外生物膜形成实验表明，SynCom C的这六个HFS在生物膜形成中协同作用（图5c）。此外观察到这六种HFSs在板上通常相互吸引（图5d）。综上所述，SynCom C的这6个HFS协同组装成一个联盟，以抵抗根结线虫的根感染。

为了进一步表征SynCom C菌株的功能，对植物生长促进（PGP）的相关特征进行研究。SynCom C的6种HFSs均可积累一种或多种特定代谢物（图5 e）。从OD600为0.4的液体细菌培养的上清液中获得的所有菌株的总代谢物均强烈抑制了根结线虫的卵孵化和感染J2的存活率（图5f、g）。此外，所有菌株的总体代谢物均有效抑制了对黄瓜根趋化和寄生起关键作用的根结线虫flp-1和flp-18基因的表达（图5h）。在菌株代谢产物的存在下，根结线虫对黄瓜根的趋化运动被显著抑制（图5i）。根据菌株分泌物中丰度选择的几种特定代谢产物（如正缬氨酸、甜菜碱、L-赤藓糖、异烟酸、尿苷、L-胡椒果酸、泛酸、β -岩藻糖），在0.5 mM浓度下对虫卵孵化或感染性J2存活均有抑制作用图5j, k）。此外，几种特定代谢物也抑制了根结线虫flp-1或flp-18基因的表达，以及对黄瓜根系的趋化运动。综上所述表明黄瓜根相关菌株对RKNs的抑制可能涉及多种机制，如分泌抗线虫物质、抑制卵孵化、诱导感染J2死亡、阻碍趋化性和抑制迁移活动。

图5.SynComs构建

6.SynCom C对M. incognita感染的保护作用与调节植物防御反应有关

为了验证SynCom C是否会在根结线虫感染下引发植物免疫应答，进行了两水平析因试验（接种SynCom C × M. incognita感染;图6 a）。接种SynCom C显著降低了根结线虫对茎和根的严重伤害（图6a, b），说明SynCom C对根结线虫在根部发育有抑制作用（图6c-e）。

此外进行了RNA-seq来评估根系对SynCom C处理的转录反应，在所有处理之间鉴定出不同的转录模式（图6k）。对DEG的进一步检查发现了数十个与防御蛋白、细胞壁代谢、转录因子、蛋白质水解、抗氧化防御系统和苯丙素途径相关的基因（图6m）。特别是在根结线虫感染下富集的几种DEG与植物防御反应相关，并被接种SynCom C抑制（图6m）。

对SynCom C诱导的根系代谢变化进行检测，并观察到不同处理之间不同的代谢模式（图6o）。在根结线虫和SynCom C处理中分别有34和26种差异代谢物（图6p）。对差异代谢物的进一步研究发现，有超过30种代谢产物属于脂质、黄酮和木脂素（图6q），其中大多数被报道与植物防御反应有关。此外，数十种在根结线虫感染下富集的DMs被接种SynCom C抑制（图6q）。总之，SynCom C部分通过调节应激反应基因和代谢途径从根结线虫感染中拯救植物（图6r）。

图6.合成群落SynCom C对植物拯救机制解析

研究小结

本研究结合微生物组学、代谢组学、转录组学等多种组学手段，对根际土壤中的影响根结线虫感染性的主要作用微生物进行探索，结果表明最小6种细菌的组合就能有效的抑制根结线虫的活性，除了这6种细菌自身分泌的物质可以影响以外，它们的协同作用还可以促进植物根系分泌一些物质用于抗根结线虫。本研究的思路层层递进，深入的解析了植物-根际微生物之间的协作作用帮助植物抵抗外界胁迫。

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