肝细胞癌（HCC）是全球第四大癌症死亡原因，致死率极高。当前针对晚期HCC的治疗方法，主要靶向肿瘤免疫微环境（TIME），而非直接针对肿瘤细胞。前期的研究表明异常的ac4C（N4-乙酰胞苷）修饰与多种实体瘤的进展有关，但是，ac4C在HCC进展中明确的生物学意义和关键的机制仍然是个谜。2024年7月，武汉同济医院张必翔团队一篇题为“Targeting N4-acetylcytidine suppresses hepatocellular carcinoma progression by repressing eEF2-mediated HMGB2 mRNA translation”的研究成果发表在Cancer Communications期刊上，该研究揭示了NAT10-ac4C/eEF2-HMGB2表观转录组轴在调节HCC生长和转移中的关键作用，且验证了帕比司他（Panobinostat）是针对NAT10介导的ac4C的一种有效且安全的先导化合物，具有潜在的肝癌治疗价值。

迈维代谢为该研究提供了RNA甲基化靶向代谢组学检测！

研究方法

组学方法：ac4C靶向检测、转录组测序、acRIP-seq、DIA定量蛋白组检测等；

其他方法：qRT-PCR、Western blot分析、细胞培养、转染和病毒转导、免疫组化(IHC)检测等；

研究结果

1.RNA ac4C高乙酰化和NAT10上调与肝癌预后不良相关

为了阐明ac4C修饰在肝细胞癌（HCC）中的功能作用，研究人员检测了20例HCC组织和癌旁组织中RNA ac4C 的水平。点印迹（Dot blot）实验显示，HCC组织总RNA中ac4C水平显著升高（图1A）。这一发现通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）RNA甲基化靶向代谢组分析进一步得到证实，该分析显示HCC组织mRNA中ac4C水平显著升高（图1B）。比较了20对HCC和正常肝组织中NAT10（负责ac4C修饰的唯一乙酰转移酶）的mRNA水平，结果表明NAT10在HCC中显著上调，并且在20例HCC组织中NAT10表达与 RNA ac4C水平之间存在显著相关性。为了进一步验证这些结果，研究人员对来自89组HCC患者的数据进行了大规模数据挖掘分析。其中62个队列内mRNA NAT10 水平有显著变化。54个队列HCC组织中mRNA NAT10 水平显著升高（图1C）。接下来，使用来自临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（CPTAC）的数据集进行了基因表达分析，该数据集支持NAT10在HCC中的上调（图1D）。与这些发现一致，通过蛋白质印迹法分析，人HCC组织中NAT10的蛋白质水平显著高于癌旁组织（图1E）。对来自HCC组织微阵列（同济队列）的103对样本的免疫组织化学分析，进一步证实了HCC样本中NAT10的上调（图1F）。此外，NAT10的高表达与HCC患者的总生存期和无复发生存期显著缩短有关（图1G）。

后续分析表明，NAT10高表达与患者HCC组织和与不良预后相关的分子亚型iCluster-1 HCC样本中的临床晚期显著相关。NAT10表达在HCC发展过程中逐渐增加（图1H）。综上所述，这些发现表明NAT10表达与HCC的恶性进展密切相关。

图1.在HCC患者中，NAT10表达升高与预后不良相关

2.下调NAT10可抑制HCC的增殖和转移

为了研究NAT10在肝细胞癌（HCC）中的功能，研究人员使用NAT10表达和ac4C修饰水平均升高的细胞系（MHCC-97H和SNU449）建立了稳定的NAT10敲低细胞系。与对照shRNA（shCtrl）相比，NAT10的敲低显著降低了总RNA和mRNA中的ac4C含量（图2A）。NAT10沉默显著抑制了HCC细胞的活力（图2B-C）、克隆形成能力（图2D）以及软琼脂菌落形成效率（图2E）。此外，伤口愈合迁移、Transwell迁移和基质胶侵袭实验表明，NAT10沉默显著抑制了MHCC-97H和SNU449细胞的迁移和侵袭能力（图2F-G）。随后，研究人员评估了NAT10在体内对HCC增殖和转移的影响。肿瘤异种移植研究表明，NAT10沉默显著抑制了肿瘤生长，表现为与对照细胞来源的肿瘤相比，肿瘤大小和重量减少（图2H）。此外，肿瘤异种移植中NAT10的敲低导致细胞增殖受到抑制并诱导凋亡，这分别通过Ki-67和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记（TUNEL）染色得到证实（图2I-J）。此外，在肝脏原位植入模型中，与对照组相比，接种NAT10敲低细胞的组肝内肿瘤结节的体积和数量显著减少（图2K）。此外，在通过向裸鼠的侧尾静脉注射NAT10敲低细胞和阴性对照细胞建立的肺转移模型中，NAT10沉默显著抑制了HCC的肺转移（图2L）。综上所述，这些发现表明NAT10在HCC的增殖和转移中作为致癌驱动因子发挥着关键作用。

图2.在体外和体内，NAT10敲低抑制HCC进展

3.NAT10对mRNA ac4C修饰和全局mRNA翻译的影响

分别对NAT10敲除和不敲除的MHCC-97H细胞中进行了acRIP-seq实验（图3A）。确定了对照组细胞中来自4784个ac4C修饰的转录本的共11591个ac4C峰，以及NAT10缺陷细胞中来自691个ac4C修饰的转录本的3148个峰（图3B-C）。值得注意的是，在稳定的NAT10敲除细胞中出现了609个新的峰，而9052个峰消失了（图3B）。由于NAT10是一种ac4C乙酰转移酶，因此这9052个独特的峰预计包含NAT10的真正靶标。在检测到的峰中富集了ac4C共有基序“CXX”（图3D），这与先前的研究结果一致。随后，研究人员比较了有或没有shNAT10的HCC细胞中的acRIP-seq数据，分析了差异ac4C峰及其对应的转录本。在shNAT10细胞中鉴定出125个转录本显示出ac4C峰减少（图3F），这些结果共同表明NAT10在HCC中介导ac4C mRNA乙酰化。通过RNAseq和Ribo-seq实验，鉴定受NAT10介导的ac4C修饰影响的下游功能效应子（图3G）。NAT10的耗竭极大地改变了基因转录表达和核糖体保护片段（RPF）的丰度（图3H）。从RNA-seq中，在NAT10耗竭后检测到635个下调和818个上调的转录本。从Ribo-Seq中，NAT10敲低后鉴定出277个下调和332个上调的转录本。mRNAs ac4C（-）在响应NAT10缺失时显示出特定的T.E（翻译效率）升高（图3I）。多聚体分析显示，在NAT10缺陷细胞中，80S单体和多聚体的组装显著减少（图3J），表明NAT10的耗竭抑制了全局蛋白质翻译。此外，使用SUnSET试验测定时，NAT10的耗竭显著抑制了蛋白质合成（图3K）。所有这些结果表明NAT10介导的mRNA ac4C修饰增强了肝细胞癌中的全局翻译效率。

图3.NAT10对mRNA ac4c修饰和全局mRNA翻译的影响

4.NAT10介导的ac4C修饰增强HMGB2 mRNA的翻译

研究人员将来自acRIP-seq、RNA-seq和Ribo-seq的重叠候选基因进行重叠，以精确定位下游靶标（图4A）。在潜在的NAT10下游靶标（HMGB2、HIF0、PITX1和STC2）中，HMGB2在NAT10耗竭后显示出最显著的下调（图4B-C），这表明HMGB2可能是HCC细胞中NAT10的直接靶标。acRIP-seq和Ribo-seq数据显示，在NAT10缺陷细胞中，CDS中的ac4C富集和核糖体占据率显著降低（图4D）。相应地，NAT10敲低显著降低了HMGB2 mRNA的ac4C水平和蛋白质表达（图4E-F），而其mRNA丰度未受影响。有趣的是，使用MG132抑制蛋白酶体未能恢复NAT10沉默的HCC细胞中HMGB2的蛋白质表达（图4G），这表明NAT10诱导的HMGB2表达不受蛋白质降解变化的影响。将HMGB2 CDS连接到多克隆位点（MCS）来构建了pmirGLO-HMGB2荧光素酶报告基因，双荧光素酶测定清楚地表明，与对照细胞相比，NAT10缺陷细胞中HMGB2的翻译效率显著降低（图4H，补充图S4B-C）。此外，与对照细胞相比，NAT10缺陷细胞中HMGB2 mRNA在核糖体组分中的分布显示翻译活性多聚体（> 80S）显著减少（图4I）。这些综合结果表明，ac4C诱导的HMGB2表达与翻译调控有关。

在NAT10敲低细胞中过表达HMGB2显著恢复了细胞的体外增殖和侵袭能力。此外，体内实验表明，HMGB2完全挽救了NAT10敲低后的异种移植瘤生长和肺转移（图4J-L）。该数据表明，HMGB2是NAT10的关键功能性靶标。此外，在同济医院和CPTAC队列中分析了HMGB2的临床相关性，揭示了HCC组织中HMGB2的表达升高。相关性分析进一步揭示了HCC中高表达的HMGB2与NAT10水平之间存在显著关联（图4M-N）。此外，生存分析表明，这两个基因的高表达均预示着最差的总体生存期（OS）和无复发生存期（RFS）。综上所述，NAT10介导的ac4C修饰通过增强HMGB2的翻译促进了HCC的恶性进展。

图4.ac4C的修饰增强了HMGB2的翻译

5.HMGB2 mRNA的CDS ac4C位点增强eEF2的结合

RNA的乙酰化也可能影响相互作用蛋白的结合，这与特异性结合蛋白通过介导mRNA翻译来识别RNA中的N6-甲基腺苷相似。为了鉴定直接结合ac4C修饰的蛋白质，研究人员使用含有或不含ac4C的生物素标记寡核苷酸进行了RNA亲和色谱法和数据非依赖性采集（DIA）蛋白质组学定量检测（图5A-B）。结果，在ss-ac4C组中，检测到123种蛋白质。GO分析表明，蛋白质主要富集在翻译延伸和翻译等方面（图5C）。此外，还在STRING蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据库中搜索了这些鉴定出的蛋白质，以查找已知的PPI，并根据通过GO分析获得的已知功能对蛋白质节点进行了分组。根据这些蛋白质已知的生物学功能，将它们分为六个主要亚群，包括翻译、靶向内质网、核糖核蛋白等。所有这些结果都表明，ac4C修饰参与了翻译过程。对ss-ac4C和acFUS结合蛋白进行重叠分析，鉴定出了eEF2和SRP68（图5D-E）。RNA下拉实验证实，eEF2和SRP68优先结合ac4C修饰的寡核苷酸（图5F）。随后，为了确定eEF2或SRP68是否参与HMGB2翻译的调控，首先通过瞬时siRNA介导的eEF2和SRP68敲低来评估HMGB2的表达。结果发现，eEF2敲低后HMGB2蛋白显著下调。此外，RNA下拉实验进一步证实，eEF2确实对ac4C修饰的RNA显示出更高的结合能力（图5G）。这表明eEF2是ac4C乙酰化mRNA的特异性结合蛋白。此外，内源性eEF2的RNA免疫沉淀（RIP）显示，eEF2结合的RNA中ac4C修饰显著富集。此外，NAT10的耗竭相应减少了eEF2在80S核糖体和多核糖体中的分布，这支持了eEF2作为ac4C识别器的观点。为了验证eEF2是否参与HMGB2 mRNA的ac4C乙酰化，使用RIP-qPCR研究了HMGB2 mRNA与eEF2之间的相互作用。数据显示，eEF2在HMGB2 mRNA中显著富集，而在NAT10缺陷细胞中，这种相对富集被显著抑制（图5H）。NAT10的过表达导致HMGB2蛋白表达上调，而eEF2敲低后这种上调被显著减弱。这些发现表明eEF2参与了ac4C修饰调控的HMGB2表达。

使用ac4C抗体对有无NAT10缺陷的肝癌细胞中的片段化RNA进行了免疫沉淀（图5J）。结果表明，ac4C主要富集在HMGB2的外显子1/2/3和5′UTR，而不是3′UTR。有趣的是，NAT10缺陷细胞中，外显子2、外显子3和5′UTR的ac4C富集显著降低，而外显子1则没有观察到类似效应（图5J）。HMGB2 5′UTR-报告基因荧光素酶测定结果显示，对于野生型和突变型5′UTR构建体，NAT10缺陷细胞与对照组之间在翻译上没有显著差异。研究人员构建了一个仅包含野生型HMGB2 CDS的表达构建体，以及在CXX富集区引入C到T的突变，构建了三种突变型HMGB2 CDS变体（突变体1/2/3），在所有三种突变体中，HMGB2蛋白水平几乎完全恢复（图5K）。相应地突变了pmirGLO-HMGB2荧光素酶报告基因，并进行了双荧光素酶测定，结果显示，所有三种突变体都减弱了NAT10对HMGB2翻译的抑制作用（图5L），这表明HMGB2外显子2和外显子3中的乙酰化是ac4C调控HMGB2 mRNA翻译的关键位点。为了验证eEF2是否参与HMGB2 mRNA中已确定的三个ac4C乙酰化位点，进行了RNA免疫沉淀-定量PCR（RIP-qPCR）来探究HMGB2 mRNA与eEF2之间的相互作用。RIP-PCR的结果显示，eEF2主要与HMGB2 mRNA中已确定的乙酰化CDS区域相互作用，而不是5′UTR区域（图5M）。这一相互作用通过RNA下拉实验得到了进一步证实，该实验验证了eEF2与HMGB2乙酰化CDS区域的结合（图5N）。这些数据强烈表明，eEF2可能是肝癌细胞中ac4C诱导的HMGB2 mRNA翻译的关键因子。

图5.HMGB2 mRNA的CDS ac4C位点增强了eEF2的结合

6.帕比司他（Panobinostat）作为NAT10介导的ac4C抑制剂的鉴定与表征

研究人员构建了表达野生型NAT10或其催化突变体（G641E）的质粒，已知该突变体会损害NAT10的RNA乙酰转移酶功能。分析结果显示，与野生型细胞相比，催化突变体NAT10的细胞中ac4C水平显著降低（图6A）。重要的是，研究人员发现NAT10的ac4C催化活性域（G641）对于其促进HCC细胞增殖和侵袭的作用至关重要。此外，催化突变体NAT10的过表达显著抑制了蛋白质合成。同时，催化突变体NAT10的过表达对HMGB2蛋白水平或mRNA ac4C水平没有影响（图6A）。研究人员基于结构的虚拟筛选、NAT10的催化口袋、抗肿瘤活性等方法选择了帕比司他作为NAT10抑制剂（图6B）。对接模型表明，帕比司他紧密结合NAT10蛋白并阻断其催化口袋（图6C）。随后，表面等离子共振分析（图6D）显示帕比司他与NAT10之间具有高亲和力（KD = 8.544 µM）。此外，帕比司他处理导致NAT10蛋白的热稳定性发生显著变化（图6E），表明其能够与NAT10结合。药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）试验进一步证实了它们之间的直接相互作用（图6F）。点印迹分析表明，帕比司他处理以剂量依赖的方式显著降低了总RNA和mRNA中的全局ac4C丰度（图6G-H）。此外，帕比司他处理显著抑制了蛋白质合成并抑制了HMGB2的表达（图6I）。而且，帕比司他在肝细胞癌细胞中导致HMGB2 mRNA的ac4C水平（图6J）和HMGB2翻译效率（图6K）显著降低。此外，富含在HMGB2 mRNA中的eEF2在帕比司他处理的细胞中受到显著抑制（图6L）。这些发现共同表明，帕比司他表现出对NAT10催化口袋的选择性结合和占据，从而抑制靶标RNA转录本中的ac4C修饰。

图6.NAT10抑制剂帕比司他（panobinostat）的特征

7.帕比司他在体内和体外均表现出抗肝癌活性

帕比司他显示出对MHCC-97H细胞生长的剂量依赖性抑制作用（图7A），其半数抑制浓度（IC50）为4.469 nmol/L。与NAT10敲低一致，帕比司他显著抑制了细胞增殖和侵袭（图7B-C）。随后，体内评估了帕比司他的抗肝癌作用（图7D），发现其并未引起体重减轻。在皮下异种移植模型中，帕比司他以剂量依赖的方式有效抑制了异种移植肿瘤的生长（图7E）。为了进一步验证NAT10介导的ac4C在体内的抑制作用，研究人员分别使用点杂交和Western blot检测了经帕比司他处理和对照小鼠异种移植肿瘤组织中的RNA ac4C水平和HMGB2蛋白表达。与对照小鼠相比，经帕比司他处理的小鼠RNA中的ac4C水平显著降低（图7F）。此外，帕比司他有效抑制了小鼠体内HMGB2的蛋白表达（图7G）。组织病理学检查进一步证实了帕比司他的疗效，表明其对体内NAT10和HMGB2表达的抑制作用（图7H）。此外，与对照组相比，经帕比司他处理的组肝内肿瘤结节的体积和数量均显著减少（图7I）。值得注意的是，与对照组相比，生物发光成像和肺转移病灶定量结果表明，帕比司他治疗显著抑制了肝癌细胞的肺转移（图7J）。综上所述，这些数据表明帕比司他是针对NAT10介导的ac4C的一种有效且安全的先导化合物，具有潜在的肝癌治疗价值。

图7.帕比司他在体外和体内均显示出良好的抗HCC疗效

研究结论

该研究确定了NAT10介导的ac4C修饰触发了肝癌（HCC）中HMGB2的异常上调。作为NAT10的功能靶点，它刺激HMGB2 mRNA编码序列（CDS）内的ac4C修饰，从而增强HMGB2的翻译。此外，该研究还揭示了eEF2作为ac4C修饰mRNA的新型阅读器，展示了其与HMGB2 mRNA CDS内ac4C位点的结合并促进HMGB2的翻译。值得注意的是，该研究已经确定了帕比司他作为一种强效的NAT10-ac4C抑制剂，可有效阻止肝癌的进展。综上所述，该研究阐明了NAT10介导的mRNA ac4C修饰在肝癌发展中的关键作用，并强调了NAT10/ac4C作为肝癌治疗靶点的治疗潜力。

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